一致好评金域论文带你剖析儿童遗传病问题
又见金域给力的小伙伴的身影啦（此次应有掌声~~），这次由金域集团伙伴们：袁海明、赵薇薇、陈梦帆、李欣蔚等人参与发表的两篇文章刊登在国内外权威期刊，它们分别是《染色体微阵列技术在例儿科患者中的应用》（中华医学会遗传学杂志年4月第33卷第二期）和《一例罕见15q15.3q21.2新生片段重复患儿伴身材矮小，生殖系统发育不良，全面性发育迟缓和智力低下》（(Yuanetal.MolecularCytogenetics()9:2DOL10./s---3)）。
想看看这两篇论文的不平凡之处在哪里吗？小域下面带你细细品味！（文章有点长，要有耐心哦~）
染色体微阵列技术在例儿科患者中的应用出生缺陷也称先天异常，是指由于遗传因素、环境因素或两者共同作用于孕前或孕期，引起胚胎或胎儿在发育过程中发生解剖学结构和(或)功能上的异常。染色体病是导致出生缺陷的一类遗传性疾病，据报道我国新生活婴中染色体异常者约占0.73%。拷贝数变异(copynumbervariants,CNVs)指大于1kb染色体变异（基因组变异），包括核型分析检测不到的基因组微缺失和微重复，广泛存在于人类基因组中。已有大量研究证实CNVs与许多疾病相关，包括数百种染色体微缺失、微重复综合征，并且是先天畸形和神经发育障碍的主要病因，包括智力低下(mentalretardation,MR)[5,6]，自闭症(autism),精神分裂症(Schizophrenia)等。传统的染色体核型分析通常可检测5Mb以上的遗传物质改变，无法对许多具有致病性的染色体亚显微结构变异--染色体微缺失/微重复做出检测，此外此技术需要细胞培养，操作耗时较长。染色体微阵列(chromosomalmicroarrayanalysis,CMA)又称为染色体芯片，可在全基因组范围内同时检测染色体微缺失、微重复等基因组失衡现象和单亲二倍体(uniparentaldisomy,UPD)、嵌合体等，对出生缺陷患儿检出率达到15-20%，而核型分析为3%左右。目前CMA已作为产前、产后遗传病诊断中的一线诊断技术。我们应用CMA对例出生缺陷患儿进行检测，并通过对夫妻双方进行检测，对再次生育进行了遗传风险评估。
1对象与方法1.1对象
收集送检金域医学检验中心例出生缺陷患儿，例如不明原因智力低下、发育迟缓、多发畸形、自闭症、癫痫等。患儿年龄在4天~16岁之间，男女比例约为9:7。所有患儿均由其父母或监护人签署知情同意书。
1.2方法
1.2.1CMA分析
采取患儿2mL静脉血，应用QIAGEN试剂盒提取基因组DNA。应用美国Affymetrix公司CytoScanHD(万CNV探针+75万SNP探针)芯片对样本进行检测。对所得的原始数据应用AffymetrixChromosomeAnalysisSuiteSoftware进行分析。参照国际基因组CNV多态性数据库DGV，UCSCGenomeBrowser，DECIPHER及ISCA数据库及相关文献判读CNV。
1.2.2CMA结果
解读按照美国ACMG指南，将CNVs分为4个等级：(1)临床致病性CNVs；(2)临床可能致病性CNVs；(3)临床意义不明CNVs；(4)良性CNVs。对于临床意义不明CNVs，需验证该CNVs是新生突变还是遗传自父母，再进行判断。
2结果2.1临床表型分类
对例出生缺陷患儿进行检测，阳性为例(包括临床致病性CNVs、可能致病性CNVs和UPD)，阳性率为26.1%。临床送检的样本患者的临床表型往往并不单一，如以发育迟缓为主就诊的患者中往往合并智力低下、多发畸形、癫痫等。我们按照临床表型进行分类，并对各类别所检阳性率进行统计分析发现，合并不同临床表型的患者应用CMA检测阳性率间有显著差异(见表1)。从表中数据分析可得知多系统发生异常的阳性率远高于单一表型的阳性率，这些数据可为临床送检提高阳性率做为参考。
▲表1例出生缺陷患儿的临床表型及检测结果
2.2CNVs类型分类
根据例阳性样本所检测CNV类型分为染色体内微缺失或微重复，染色体末端缺失或重复，染色体末端同时发生缺失和重复，非整倍体，嵌合体和UPD等6类(表2)。并总结所检测出的主要临床致病性微缺失/微重复综合征(阳性例数≥3)(表3)，UPD(表4)以及嵌合体(表5)
▲表2例阳性病例CNV类型
▲表3检测出的临床致病性微缺失/微重复综合征(阳性例数≥3例)在染色体的分布及发生率
▲表4例阳性样本中所检测出的UPD类型及与疾病相关性
▲表5例阳性样本中所检测出的染色体嵌合体类型及发生率
2.3遗传方式分类
患儿检测出致病位点后，应用CMA或荧光原位杂交（fluorescenceinsituhybridization,FISH）技术对患儿父母进行检测，见表6。若父母携带同样致病片段或相应片段发生染色体平衡易位，再次生育遗传风险高，建议再次生育及早做产前诊断或植入前遗传病诊断，以避免再次生育同样疾病的患儿。
▲表6部分染色体微缺失/微重复阳性样本按其遗传方式分类
3讨论CMA技术分辨率高，无需要标本培养，检测流程标准化，操作周期短，相比于核型分析具有明显优势，因此已替代核型分析成为产后遗传病诊断的一线技术，目前已广泛应用于智力低下、发育迟缓、多发畸形、自闭症等检测。
我们对临床诊断为出生缺陷的例样本进行了CMA检测，共检测出例阳性样本，检出率高达26.1%，高于国外报道15-20%的检出率。原因是临床送检CMA检测的患儿临床症状较严重。从表2可以看出，例均是有两个及两个以上系统发生异常，患儿均有中重度智力低下，发育迟缓，且往往同时伴有多发畸形、自闭症、癫痫等等，故检出率较高。对所有检出临床致病性和可能致病性CNVs片段大小进行分析发现，片段大于5Mb病例为92例(包括非整倍体)，加上7例整条染色体发生嵌合，而应用核型分析进行检测，在较理想情况下检出率为4.95%，远低于CMA检出率。并且核型分析需要标本培养，耗时耗力，对技术人员依赖性比较强。
需要指出的是，CMA也存在局限性：(1)不能检测染色体平衡易位(相互易位、罗伯逊易位、倒位、平衡插入)；(2)不能检测点突变及串联重复序列扩增导致的遗传病；(3)不能检测到低于本平台检测下限的基因组不平衡现象；(4)会检测出临床意义不明CNVs。由于CMA不能检测染色体平衡易位，故核型分析和FISH技术在某些特定情况下具有优势。例如在先证者利用CMA检测出在染色体末端发生缺失和（或）重复，若要了解患儿致病片段遗传方式及对夫妻双方再次生育做遗传风险评估时，此时就需要利用FISH或核型分析(视片段大小)对夫妻双方进行检测。又如检测出13,14,15染色体发生UPD，此时对患儿父母进行检测时就需要利用核型分析以排除该染色体发生罗伯逊易位的可能性，以便对再次生育做遗传风险评估。在此种情况下，核型分析、FISH将弥补CMA技术的不足。
CMA会检测到临床意义不明CNVs，给结果解释带来困难与挑战。这就使得我们如何选择染色体芯片成为问题。目前商业化芯片设计的探针在整个基因组均匀覆盖，可检测到许多已知良性CNVs，无疑会浪费探针空间，增加成本，同时也会检测到临床意义不明CNVs，给结果解读带来困难，益处就是可以发现未知CNVs。国外多个实验室根据以往的经验设计了多款“靶向微阵列芯片”，在靶向已报道的与遗传性微缺失和微重复综合征相关区域和在人类孟德尔遗传(OMIM)确认的致病基因所在区域增加探针密度，同时包含全基因组的骨架区域(backbone)，减少人群中良性CNVs区域的探针密度，甚至不设计探针。这类芯片无疑对产前诊断的结果解释非常有利。医院研发的ClariViewArray芯片(4×k)、贝勒医学院研发的BCMaCGH+SNP芯片(4×k,2×k)、国际细胞基因组芯片标准协作组(ISCA)研发的ISCAaCGH+SNP芯片(4×k)以及香港中文大学研发的胎儿芯片aCGH(4×44k)均为靶向微阵列芯片。
CMA检测适应证较广泛，智力低下、发育迟缓、多发畸形及自闭症等均适用于CMA检测。随着人们对CNVs认识的加深和CMA在临床诊断能力的逐步推广，癫痫、先天性心脏病、矮小、肥胖、注意缺陷多动障碍等也已被推荐为CMA检测的适应证。CMA对出生缺陷患儿疾病诊断、预后和治疗以及夫妻双方再次生育的遗传风险评估都起到积极的指导作用，显示出了强大的临床功效，必将能够有效的为临床服务。
——摘自：中华医学会遗传学杂志年4月第33卷第二期
一例罕见15q15.3q21.2新生片段重复患儿伴严重身材矮小，生殖系统发育不良，全面性发育迟缓和智力低下背景介绍15q近端发生微缺失与微重复是很常见的，15q11.2-q13区域存在BP1-BP5五个常见断裂点。BP1-BP3断裂点间的缺失与Prader-Willi和Angelman综合征相关；而相应区域的重复(尤其是母源15q11.2-q13重复)与15q微重复综合征相关，其典型临床表现为全面性发育迟缓，自闭症谱系疾病和癫痫。BP4-BP5区间的15q13.3微缺失和微重复综合征与神经发育和神经精神类疾病相关。包括IGF1R基因的15q末端三体、四体通常诊断为15q26过度生长综合征，其典型表现包括过度生长，学习困难，特殊面容及其他先天异常。而15q26单体则表现出相反的临床表型包括产前与产后发育迟缓及其他畸形特征。少量文献报道15q25.2近端缺失会导致先天性膈疝，认知困难和Diamond-Blackfan贫血，而其远端缺失则与神经发育和神经精神类疾病相关。然而15q远端至15q13区间的重复是非常罕见的，迄今为止仅有两例报告。Elcioglu()曾报道一例生殖系统发育不良，骨骼异常，马凡氏综合征样表现，发育迟缓和智力低下的患儿，经检测发现该患儿在15q13.3-q21.3区域发生新生片段反向重复。Herr()报道一例15q14-q21.1新生重复片段的病例，患儿也同样表现为生殖系统发育不良，骨骼异常，身材矮小，骨龄延迟，发育迟缓和智力低下等。这两例检测方法均为高分辨G显带核型分析，因此无法精确其重复片段的位置和大小。本文报道一例14岁男性患儿表现为生殖系统发育不良，身材矮小，全面性发育迟缓和多发性先天异常，经染色体微阵列检测发现在15q15.3q21.1区域发生6.4Mb新生重复片段。
病例报道先证者为男性患儿，其父母非近亲婚配且已生育3个健康孩子。其母在孕7个月时超声提示宫内发育迟缓，孕38周自然分娩。患儿出生体重2.9kg(＜-1SD)，身长47cm(＜-2SD)，头围34cm，Apgar评分均为9分。无喂养困难史。
患儿产后发育迟缓：4个月抬头，9个月会坐，1岁6个月独立行走，语言发育明显落后。患儿在14岁时做了详细检测，身高cm(＜-2SD)，体重33.5kg(＜-2SD)，头围54cm，这表明持续性发育迟缓。中等程度智力低下，学习困难。其特殊面容包括大头畸形，皮肤粗糙，宽前额，眼窝深陷，眼距宽，斜视，宽鼻梁，浅人中，厚嘴唇。严重矮小身材，手腕X线检测提示骨龄延迟(图.1)。然而生长激素水平(6.19ng/ml)和生长激素激发试验(11.6ng/ml)均为正常。垂体核磁共振及甲状腺激素检测也正常。患儿小阴茎，小睾丸，低睾酮。其余无异常发现。
▲图.1:患儿14岁。查体可见：大头畸形，皮肤粗糙，宽前额，眼窝深陷，眼距宽，斜视，宽鼻梁，浅人中，厚嘴唇。手腕X线检测显示骨龄延迟。
方法1染色体微阵列
QiagenDNA提取试剂盒提取先证者及其父母外周血DNA，应用美国Affymetrix公司CytoscanHD芯片对样本DNA进行检测，AffymetrixChromosomeAnalysisSuite软件对数据进行处理和分析。
2重复片段验证
利用Real-timePCR方法对染色体微阵列检测结果进行验证。
结果染色体微阵列检测发现患儿在15q15.3q21.2(chr15:44,,-50,,)发生6.4Mb片段重复，其父母在相应区域无拷贝数重复。由此证实患儿携带的重复片段为新生突变。Real-timePCR方法进一步证实了染色体微阵列的检测结果。
▲图.2：AffymetrixcytoscanHD芯片结果包括weightedlog2ratio(上),copynumberstate(中)和allelepeaks(下)。结果提示15q15.3q21.2区域发生片段重复。基因组位置：chr15:44,,-50,,(hg19)。重复片段以蓝色条标示。
讨论除15q11-q13区域外的15q内部微重复和微缺失是非常罕见的。本文报道了一例14岁男性患儿表现为严重身材矮小，骨龄延迟，生殖系统发育不良，全面性发育迟缓，智力低下和特殊面容。经染色体微阵列检测发现在15q15.3q21.1区域发生6.4Mb片段重复，而同时检测到的其它拷贝数改变均不具有临床意义。DGV数据库未发现该区域重复，又由于是新生突变，因此推测该片段重复很可能是导致其临床表型的原因。接下来我们检索文献和数据库覆盖该区域的病例，检索到DECIPHER数据库3例,ISCA数据库1例,文献报道2例。这些病例具体位置及片段大小见图3，详细临床信息见表1。
▲表q13.3q22区域发生片段重复的患者基因组及临床信息。基因组坐标基于GRCH37/hg19版本
▲图.3：蓝色条形图显示数据库和文献报道15q13.3q22区域内拷贝数重复病例，红色条块表示15q21.1关键区。下部图示标明15q21.1区域所包含候选基因。备注：Herr和Elcioglu所报道的病例诊断方法为高分辨G显带，故其在基因组中的定位是大概位置。
Elcioglu()与Herr()分别报道1例新生突变重复病例，分别位于15q13.3q21.3与15q14q21.1区域。Decipher重复片段完全覆盖本病例。在这4例病例中，本文病例重复片段最小，并集中覆盖15q21.1区域。我们注意到3例病例(本文病例,Decipher和Herr报道病例)均表现出极其相似的临床表型如生殖系统发育不良，矮身材，骨龄延迟，全面发育迟缓及智力低下。有趣的是Elcioglu所报道的病例表现出绝大多数相似的临床表型，但却表现出马凡综合征样特征如高身材。除Decipher病例(缺少父母验证信息)外，其余病例均为新生突变，在DGV中均无报道，且临床表现及其相似尤其是生殖系统发育不良和骨骼异常，这些线索均进一步证实了这些重复片段很可能是临床致病性的。
为进一步阐明该重复片段的致病性，我们鉴定了重复片段内的能够解释患者临床表型的候选基因。该重复片段内包含FBN1()基因，该基因不同的点突变可引起完全相反的临床表型。如FBN1突变可导致acromicric发育不良，表现为身材矮小，四肢短小，骨龄延迟，关节强硬，特殊面容等。FBN1突变也可导致Weill-Marchesani综合征，表现为身材矮小，眼异常，短指，关节强硬和心脏病等。FBN1突变也是马凡综合征的病因，但表现为高瘦身材，蜘蛛指，眼和先天性心脏病。因此FBN1基因重复可解释患儿骨骼发育异常。
在该重复区域，除了FBN1基因能够解释患儿骨骼发育异常的临床表型外，没有其他已知功能基因能够解释患儿所有的临床表现。Decipher、和ISCA病例重复片段较小，集中覆盖了NOX基因家族(如DUOX2,DUOXA2,DUOXA1,DUOX1)。该基因功能缺失可导致先天性永久性甲状腺功能减退。然而，本文病例与Herr病例患儿甲状腺功能检测均为正常，而其它病例缺少相关的临床信息，因此可推断该基因重复临床意义不明，目前尚缺乏有力证据支持该区域重复具有临床致病性。
该重复区域内EID1基因是个有趣的候选基因。该基因在人体组织中广泛表达，同时在神经、心肌、骨骼肌中高表达。Liu等构建脑神经元特异性过表达人类EID1基因的小鼠模型，其研究表明EID1过表达会减弱海马长时程增强功能，并损害小鼠空间学习能力和记忆力。在细胞核中EID1与CBP/p紧密结合并抑制其功能。CBP/p属CREB结合蛋白家族，与Rubinstein–Taybi综合征相关，其典型临床表现为矮小身材，智力低下，发育迟缓和特殊面容。人脑中EID1基因过表达会抑制CBP/p活性，从而导致神经功能损害。此外EID-1与Steroidogenic因子-1(SF-1)共表达，而SF-1在肾上腺和生殖系统发育中起到至关重要的作用。Park等研究表明EID-1可强烈抑制SF-1的转录活性。因此可推断EID-1基因重复可能是患儿生殖系统发育不良的原因。
最后我们鉴定了该重复区域内的SEMA6D基因为另一个候选基因。SEMA6D基因是semaphorin家族VI亚型成员之一，在肾、脑和胎盘高表达，心肌与骨骼肌中度表达。SEMA6D在成人组织中高表达使其成为在神经系统功能维持和修复中的重要因子，也可能与神经发生，组织发生、再生过程或退行性病变过程有关。因此我们认为SEMA6D过表达可能与患儿神经系统发育异常相关。
结论我们报道了一患儿在15q15.3q21.2区域发生新生重复突变，其临床表型包括骨骼发育异常，生殖系统发育不良，全面性发育迟缓，智力低下和特殊面容等。我们鉴定了15q21.1区域多个功能基因能够解释患儿的临床表现。因此我们提出15q21.1区域重复为一个新颖的连续基因重复综合征。对该区域重复的致病性进一步研究是非常有必要的。
——译自：(Yuanetal.MolecularCytogenetics()9:2DOL10./s---3)
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