SCI文献解析揭示如何进行蛋白质转运研究

什么是蛋白质转运？

除了少量的蛋白质由线粒体和叶绿体DNA编码外，其余蛋白质都是由细胞核DNA编码，在细胞质游离/吸附的核糖体上合成。

细胞要发挥正常功能，必须使每一个蛋白质都要在膜（细胞膜，细胞器膜）或水相腔室（细胞质，细胞器基质或内膜腔）中正确定位。

如受体蛋白、离子通道蛋白和转运蛋白需要嵌在质膜内。DNA、RNA聚合酶需要运送到核里。蛋白酶和过氧化氢酶应分别转运至溶酶体和过氧化物酶体。其他如细胞外间质和激素则需要分泌到细胞外。

也就是说蛋白质转运是

*细胞内将新合成的蛋白分类，修饰并运输到正确目的地的过程。

*可以将蛋白质转运形象化类比为街道上移动的交通工具：多方向运动，遵守交通规则，高度动态，每个都具有一个最终目的地。

*蛋白质转运/蛋白质定位/蛋白质分发，这三个术语在文献中是可以互换的。蛋白质转运主要有两条路径：内吞和外泌。

为什么要研究蛋白质的转运？

*帮助我们了解细胞稳态的关键机制，蛋白质-蛋白质相互作用，翻译后修饰和细胞间的相互作用。

*解释人类疾病发病机理，如亚细胞蛋白质转运发生错误，将会发生「转运异常疾病」，目前为止，已经发现超过30种转运异常疾病，囊性纤维病是最具代表性之一。这些疾病包括但不仅限于代谢、神经病变和癌症疾病。

如何研究蛋白质转运？

研究方法主要有以下几类

*放射自显影（脉冲追踪+电子显微镜）

*绿色荧光蛋白（GFP）+显微镜检查

*突变体+绿色荧光蛋白（GFP）

*生化分析和无细胞系统

*亚细胞结构分离+Western，IP，交联质谱技术（XL-MS）

其中亚细胞结构分离+Western，IP，交联质谱技术（XL-MS）是目前最常用的方法。

亚细胞结构分离方法研究蛋白转运应用举例

ExampleA.ULBP2TraffickingBlockageLeungWH.,etal（）。J.ofImmunol.,SpinColumn-BasedFractionation.

Leung等人[1]研究PRL-3对ULBP2蛋白转运的影响。人结肠癌细胞系HCT使用40uMPRL-3处理，然后使用离心管柱法进行亚细胞结构分离。

结果显示，细胞质膜，细胞器和细胞浆组分被彻底分离，经过化学处理后的细胞导致ULBP2从细胞膜迁移到细胞器组分，而各组分中其他蛋白质在PRL-3处理前后无明显变化。

ExampleB.HIVGagProteinTraffickingButluayetalCell.（），SpinColumn-BasedFractionation.

Kutluay等人[2]研究HIV-1病毒颗粒组装过程中Gag-RNA复合体的分布及变化情况。实验中关键步骤之一是证明在不同亚细胞结构中Gag-RNA复合体表现出不同形式。

用HIV-1病毒质粒转染4SU-fedT细胞后，通过离心管柱法进行亚细胞结构分离，分离后的细胞浆和细胞膜组分进行Western印迹和免疫沉淀实验。

结果表明，胞浆中的Gag蛋白主要是单体形式，而细胞质膜上的Gag蛋白是多聚体形式（图B）。这一结论很大程度上取决于细胞浆和细胞质膜组分的彻底分离（图A）。

ExampleC.IsolatedPlasmaMembraneShowsClearerSignals

KashiwagiY.etal.PLOSone（）,SpinColumn-BasedFractionation.

大部分质膜蛋白为低丰度表达，没有经过分离和富集时很难检测和定量。上图数据[3]显示质膜蛋白富集后对灌注后小鼠心脏样品中SGLT1检测效果的影响。与总膜部分相比，SGLT1和质膜蛋白内参Na+/K+ATPase信号在质膜蛋白组分中都有显着的增强。

ExampleD.DistributionofTargetProteinsGeorgiouD.K.etal.JBC（），Spin-Column-BasedFractionation.

Georgiou等人[4]研究钙离子通道复合物Cav1.1调控脂肪酸转运蛋白CD36分布和脂肪酸代谢。Cav1.1EK基因敲除小鼠（EK）和野生小鼠（WT）的肌肉组织样品，通过离心管柱法进行亚细胞结构分离，分离后的细胞浆，细胞核，细胞膜以及纯化的线粒体组分进行Western印迹检测CD36的表达及分布情况。

LaminA，GAPDH及VDAC分别为细胞核，细胞浆及线粒体组分的内参。结果表明，与WT相比，EK小鼠的CD36在细胞浆组分中增加，在质膜组分中减少。其它膜蛋白（eNOS,Cav1.1,RyR1）则无明显变化。

ExampleE.CellFractionationandIPDevarakondaetal.BMCCancer（）15:,Spin-Column-BasedFractionation.

Devarakonda等人[5]研究乳腺癌患者细胞HSP90蛋白与重链抗体（HCAb1及HCAb2）靶向结合。乳腺癌样品通过离心管柱法进行亚细胞结构分离，分离后用细胞浆和细胞膜蛋白进行IP实验。

结果表明只有HCAb2可在细胞浆中沉淀内源HSP90及重组蛋白（HSP90beta），HCAb2也可在细胞质膜中沉淀内源HSP90。

亚细胞结构分离的常用方法有哪些？

1.蔗糖密度超高速离心分离法

传统方法进行亚细胞结构分离是通过蔗糖密度超高速离心分离[6,7]，操作方法十分繁琐和耗时并且需要较大样品量。通常需要几个小时甚至几天才能完成。步骤复杂，需要特殊设备仪器，自配溶液，以及需要优良的操作技术。

2.表面活性剂提取法

大部分商业试剂盒属于这类方法。可将细胞分为两大组分：胞浆蛋白和总膜蛋白，但无法单独提取质膜蛋白组分，下游无法进行蛋白互作类研究。

3.离心管柱法亚细胞结构分离法

你可能不知道，离心管柱法是新一代的亚细胞结构分离技术。离心管柱法亚细胞结构分离无需匀浆仪和超高速离心机，简单而快速。

细胞/组织样品首先通过一个特制的离心管柱，在这个过程中细胞膜会被破裂，完整的细胞核，细胞器，质膜和胞浆蛋白被释放到溶液中，之后进一步分离成五个组分：细胞核，细胞浆，总膜，细胞器，质膜。

使用离心管柱和独特的缓冲系统配合，可以获得高回收率，低交叉污染的天然亚细胞结构蛋白，整个操作不到一小时即可完成。

分离出的天然亚细胞结构蛋白可以用于任何下游实验，离心管柱法也可用于植物样品亚细胞结构的分离。点击「阅读原文」即可了解更多相关内容。

看完以上文章，您是否对蛋白转运有了更多的了解或者对您的实验设计又多了一些新思路呢？

参考文献：1.LeungW-H.etal.().PRL-3MediatestheproteinMaturationofULBP2byregulatingthetyrosinephosphorylationofHSP60.TheJournalofImmunology.doi:10./jimmunol..

2.Kutluay,S.,etal.().GlobalChangesintheRNABindingSpecificityofHIV-1GagRegulateVirionGenesis,Cell(),







































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