文献解读多重PCR靶向捕获技术在样本

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细胞系，类器官(Organoids)，异种/同种移植模型(Xenografts/Homograftmodels)是生物医药研究领域被广泛使用的生物样本。上述样本在保存和使用过程中，较易出现样本身份错误标记，样本混样交叉污染，支原体污染等情况，会严重影响研究结果的可靠性。近期，中美冠科研发团队基于艾吉泰康多重PCR靶向捕获技术MultipSeq?，结合高深度NGS测序，建立了一种高通量、准确、快速、经济的样本身份鉴定和污染物检测的新方法。据报道，该方案能实现以下5种检测需求：生物样本身份鉴定，灵敏度高达1%；定量检测出交叉污染人源细胞中污染细胞的种类和比例；定量分析人源-鼠源混合样本中不同样本的含量比例，灵敏度达0.1%；支原体检测和分型；样本人群结构分析和性别鉴定。◤人源样本身份认证为完成细胞系、类器官和移植物等人源样本的身份认证，作者首先挑选出个SNP位点作为鉴定的指纹图谱，然后采用RNA-Seq和已发表的测序数据，对个细胞系的上述位点进行分型和频率计算，得到每个细胞系的特征性SNP指纹图谱。随后，作者团队使用一个包含上述个位点的多重PCR靶向捕获测序试剂盒，并对个细胞系（包含已知混合比例样本、未知混合比例样本和未混合样本）、个PDX样本和1个PDXO样本进行靶向深度测序，将分型结果与个细胞系特征性的SNP指纹图谱进行对比分析，发现能准确鉴定出所有样本的身份特征（表1）。表个未知混合比例细胞样本的身份鉴定结果◤混合细胞样本基因型异质率的计算和污染细胞身份鉴定作者团队根据混合样本中位点基因型的组合（表2），引入统计分析模型，对混合样本中的基因型异质率进行估算，发现个未混合样本的异质率均低于%，其中个样本的异质率均低于2%。表26种基因型组合用于估计异质率/污染率同时，作者对污染率已知的阳性混合细胞样本进行了基因型异质率分析，发现异质率数值与污染率具有高度一致性，表明基因组异质率可以作为一个准确指标，用于评估混合样本中的污染率。综上，对于一个测试样本，先用多重PCR靶向捕获测序获得个SNP位点的测序数据，计算基因型的异质率，如果异质率高于2%，提示该测试样本很有可能存在污染。然后，将SNP分型结果跟标准细胞系的SNP指纹图谱进行比对分析，确定混合细胞样本中两种样本的身份特征，实现混合样本中两种细胞的身份鉴定。◤人源-鼠源混合样本中两种样本比例的定量分析作者团队首先将人基因组序列和小鼠基因组序列进行对比分析，找到个种属特异性序列，其特征如下：序列的长度范围在-00bp；人源和鼠源基因组在上述片段区域存在显著的序列差异；上述特异性片段两侧的侧翼序列在人源和鼠源基因组中的序列一致。因此，将侧翼序列作为引物，对人源-鼠源混合样本进行扩增时，会同时得到两个序列不同的扩增产物，分别源自人源序列和鼠源序列。作者团队使用1个覆盖上述个种属特异性序列的多重PCR靶向捕获测序试剂盒，对人源-鼠源混合样本进行靶向捕获测序。发现计算得到的小鼠样本含量与实际混合比例具有极高的一致性（图1），能准确检出小鼠样本的混合比例，灵敏度可以达到0.1%。图1多重PCR靶向测序检出的小鼠样本比例与实际混合比例高度一致此外，作者团队使用类似的是技术方案成功实现支原体的鉴定和分型，人源样本的群体结构分析和性别鉴定。

生物样本特征认证研究思路

生物样本在基因水平上均存在身份特征性的碱基序列信息，如SNP位点，STR或者一段特异性序列。一般来说，生物样本特征认证主要包括以下内容：验证样本和参考样本的匹配情况（如标准肿瘤细胞系)；检测生物样本中的污染情况；识别生物样本中的污染组成和污染比例。生物样本鉴定当前主要技术方法是：采用PCR，质谱，分子杂交，基因芯片等手段获取待测样本中的目标序列，与样本身份特征性的碱基序列进行比对，实现样本的高准确度身份鉴定。生物样本鉴定的拓展应用领域：生物库样本鉴定（生物医学领域），植物种子鉴定（农业），动物品系鉴定（畜牧业），人员身份鉴定（法医）等。

多重PCR靶向捕获技术，助力多场景身份鉴定应用

多重PCR靶向捕获测序技术将多重PCR覆盖位点多、操作方便、快速、经济、通量高、对gDNA起始量低的实验优势与二代测序定量分析目标序列基因型和频率的优点结合，逐渐成为样本身份鉴定的新方向，并在实际的应用中效果显著。上文即是该方案在生物医药领域进行生物样本身份鉴定的一个成功案例。艾吉泰康在多重PCR靶向捕获领域已深耕多年，自研MultipSeq?技术平台可按需完成客户的个性化Panel定制，支持多个物种的低至数十个高至千余位点的快速设计与试剂盒转化、检测服务，已成功为生物医学领域、农业领域、畜牧业、法医领域百余家客户进行了样本鉴定试剂盒开发与技术解决方案，并将继续保持优势，不断引领多重PCR新应用的拓展。关于艾吉泰康?艾吉泰康(iGeneTech)生物科技（北京）有限公司，是坐落于北京市中关村生命科学园的高新技术企业，专注于基因检测上游的目标区域基因捕获技术研发与创新。艾吉泰康依托液相探针杂交(TargetSeq?)和多重PCR扩增(MultipSeq?)两套自主知识产权的捕获技术，形成了包含基因捕获试剂与试剂盒、捕获服务解决方案、合成生物学的多元化产品体系，致力于不断推进靶向捕获技术在精准医学、科研、大健康、农业、公卫和法医等多场景中的转化与应用。

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