荧光定量PCR模板RNA制备

年，StephenA等人提出MIQE的标准[1]，提出发表文章时所要求的最低限度的必要信息标准。MIQE标准的最终目标是建立一个清晰的框架,在这个框架中，可对RT-qPCR实验进行管理，给审稿人和编辑提供指南，使其可以使用已构建的标准对投稿文章的技术质量进行评价。同样，通过使用该方法所产生的数据对于研究结果更具有一致性，可比性和可靠性。

在前期的几篇文章中，我们已经对实验设计进行了详细介绍：多重qPCR和单重qPCR的实验设计，实验方法使用相对定量或是绝对定量。具体可查看往期文章《多重qPCR解析，你了解吗？》《荧光定量PCR——相对定量or绝对定量》。

本期文章，我们将围绕MIQE标准，对qPCR实验过程中的“获取样本”、“核酸提取”2个步骤展开。

一、样本的获取与选择

在选择不同样本时，我们首先要保证样本新鲜性。若采样完无法及时进行实验（如户外采样），则需要对样本进行保存。

常规的保存方法就是液氮保存或者-80℃保存，更要避免反复冻融。目前市面也有很多试剂耗材公司，已经生产出可以常温保存RNA样本的试剂，可以选择使用。

二、核酸提取

1.RNA提取

RNA提取的基本原则是从目标样本中提取出完整性好、质量高、纯度高的RNA。

RNA提取和抽提方式主要如下：

1.RNA质量评估

提取RNA后需要对RNA进行质量检测，常用的方法包括分光光度计、琼脂糖凝胶电泳等，以检测RNA的浓度、纯度和完整度。

lRNA浓度

由于RNA在nm处有最大吸收峰，因此可用nm波长的吸光度测定RNA浓度，其吸收强度与RNA的浓度成正比。

RNA样品浓度（μg/mL）=A×40×稀释倍数

注：A为1.0时，对应40μg/mL的的单链RNA。

lRNA纯度

RNA纯度中2个重要参数包括A/及A/：

A/在1.9-2.1之间，表明RNA纯度较好；

A/小于1.8，表明RNA中有蛋白残留；

A/大于2.2，表明RNA已经降解；

A/接近2.0最为理想，比值过低表明RNA中含有有机试剂，如酚、乙醇或糖类的残留。

lRNA完整度

提取总RNA时主要提取到三种RNA：rRNA、mRNA、tRNA。无论是在原核生物还是真核生物中，rRNA的含量在75%~85%。原核生物含三种rRNA，真核生物含四种rRNA。RNA完整度的检测方法通常有以下2种：

琼脂糖凝胶电泳：判定有无基因组污染，有无RNA降解。真核生物中28S、18S条带清晰明亮、清晰，且28S的亮度在18S的2倍以上，认为RNA质量较好。原核生物中23S、16S条带明亮、清晰，且23S的亮度在16S的2倍以上，认为RNA质量较好。如果出现弥散片状，或者无条带表示RNA降解严重，将影响后续实验。

流式芯片法：

使用生物分析仪进行毛细管进行电泳，并以软件进行分数评估。10为RNA完整性最好，0为最差。RIN≥7代表总RNA完整性比较好。

以Agilent为例，其主要通过峰图位置及峰图高度或面积来分析RNA的完整度和浓度，同时可检测RNA中是否有基因组（gDNA）的残留；但其不能检测RNA的纯度即是否有蛋白或有机试剂污染。此检测方法成本比较高，一般适用于对RNA质量要求比较高的实验，如二代或三代测序。

上述任一方法均不能同时检测RNA的浓度、纯度及完整度，需要使用其中任意两种方法同时对RNA进行分析，以保证RNA的品质。

1.如何预防RNA降解

RNA的化学性质较为活跃，是由于残基上的2’和3’位置带有羟基，形成2’,3’-环形磷酸盐的中间产物。因此在较低的自由能下就能被RNA酶切割。

RNA酶（RNase）是一种内切核糖核酸酶，可以特异性降解单链RNA，水解核糖残基和磷酸二酯键。RNase存在广泛，人体皮肤，唾液中都布满了RNase。因此更要注意避免在样品的保存或RNA提取过程中，RNase对RNA的降解。

l实验人员需要穿实验服，佩戴手套和口罩亦或头套，以防止皮屑、唾液及头屑中RNase的引入；

l提取RNA所用操作台最好是专用的，或在实验前进行RNase去除工作；

lRNA提取所用耗材如EP管或枪头等需进行DEPC处理（0.1%DEPC水浸泡过夜，高压灭菌后烘干即可使用）以失活RNase，或购买RNase-free的耗材直接使用；提取时所用的有机试剂如70%乙醇，需要用RNase-free水或0.1%的高压灭菌的DEPC水进行配置；

l目前也有专门针对RNase研发的灭活剂，将试剂稀释一定倍数后，按照说明书进行喷洒，数分钟后可以有效消灭RNase，保障实验环境的清洁。

提取后的RNA如何保存才能防止降解呢？如果只是短期储存，重悬之后可以放置于-20°C；如果是长期储存的话，就需要放置于-80°C环境保存。但是，RNase在低温的环境下仍然是具有活性的，虽降解速度有所延缓，但也是不可忽略的。因此，保存RNA时，可以加入少量的RNase抑制剂，可有效避免RNA的降解。如果要长期保存RNA，推荐将RNA溶液分装在几支管中，使用时一次性消耗，这会避免反复冻融损伤RNA导致降解的发生。

在获取到优质的RNA模板之后，下一步就要进入逆转录实验流程，如何通过逆转录获得高质量的cDNA呢？将在下一期文章中揭晓，我们不见不散

参考文献：

[1]BustinSA,VladimirB,GarsonJA,etal.TheMIQEGuidelines:MinimumInformationforPublicationofQuantitativeReal-TimePCRExperiments[J].ClinicalChemistry,,55(4):-

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