线粒体呼吸链复合体活性检测试剂盒可见

线粒体呼吸链复合体Ⅳ活性检测试剂盒（可见分光光度法）

产品货号：BA

产品规格：25管/24样

产品简介：

线粒体复合体Ⅳ又称细胞色素C氧化酶，也是线粒体呼吸电子传递链主路和支路的共有成分，负责催化还原型细胞色素C的氧化，并最终把电子传递给氧生成水。还原型细胞色素C在nm有特征光吸收，线粒体复合体Ⅳ催化还原型细胞色素C生成氧化型细胞色素C，因此nm光吸收下降速率能够反映线粒体复合体Ⅳ酶活性。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

产品组成：

溶液的配制：

工作液的配制：临用前取试剂一、试剂二、试剂三，将试剂二和试剂三依次转移到试剂一中混合溶解。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1.称取约0.1g组织或收集万细胞，加入1.0mL提取液，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。4℃g离心10min。

2.将上清液移至另一离心管中，4℃g离心15min。

3.上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅳ（此步可选做，可以判断线粒体提取效果）。

4.在沉淀中加入μL提取液，超声波破碎（功率20%，超声5秒，间隔10秒，重复12次），用于复合体Ⅳ酶活性测定，并且用于蛋白含量测定。

二、测定步骤

1.可见分光光度计预热30min以上，调节波长至nm，蒸馏水调零。

2.将工作液置于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）孵育15min；用不完的试剂4℃可保存一周；

3.样本测定（在1mL玻璃比色皿中分别加入）

立即混匀，分别记录测定管和空白管nm处初始吸光值A1和1min后的吸光值A2，测定管的记为A1测定管，A2测定管，空白管的记为A1空白管，A2空白管。计算ΔA1=A1测定管-A2测定管，ΔA2=A1空白管-A2空白管，ΔA=ΔA1-ΔA2。

三、复合体Ⅳ活力单位的计算

按样本蛋白浓度计算：

单位定义：每mg组织蛋白每分钟催化降解1nmol还原型细胞色素C定义为一个酶活力单位。

复合体Ⅳ活力(U/mgprot)=[ΔA×V反总÷（ε×d）×]÷(V样×Cpr)÷T=9×ΔA÷Cpr

V反总：反应体系总体积，8.4×10-4L；ε：细胞色素C摩尔消光系数，1.91×L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.04mL；T：反应时间，1min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL，需自行测定；：单位换算系数，1mol=nmol。

注意事项：

1.为保证实验结果的准确性，需先取1-2个样做预实验，如果测定的初始吸光值过高（高于1），可用提取液稀释后再测定。计算结果时注意乘以稀释倍数；若ΔA大于0.2，需将样本稀释适当倍数（计算公式中乘以相应稀释倍数），使A1-A2小于0.2，可提高检测灵敏度；若ΔA偏小，则可以通过增加加入的样本体积来提高灵敏度（计算公式中改变V样的体积）。

2.由于提取液中含有一定浓度的蛋白（约1mg/mL），所以在测定样本蛋白浓度时需要减去提取液本身的蛋白含量（单独测量）。

3.本试剂盒试剂足够完成25管反应。

4.附：使用样本重量计算公式：（检测样本数为25T/12S）

A、上清中复合体Ⅳ活力的计算：

单位定义：每g组织在反应体系中每分钟催化降解1nmol还原型细胞色素C定义为一个酶活力单位。

复合体Ⅳ活力(U/g质量)=[ΔA上清×V反总÷（ε×d）×]÷(W÷V提取×V样)÷T=9×ΔA上清÷W

ΔA上清：上清测定值；V反总：反应体系总体积，8.4×10-4L；ε：细胞色素C摩尔消光系数，1.91×L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.04mL；V提取：加入提取液体积，1.0mL；W：样本质量，g；T：反应时间，1min；：单位换算系数，1mol=nmol。

B、沉淀中复合体Ⅳ活力的计算：

单位定义：每g组织在反应体系中每分钟催化降解1nmol还原型细胞色素C定义为一个酶活力单位。

复合体Ⅳ活力(U/g质量)=[ΔA2×V反总÷（ε×d）×]÷(W÷V提取×V样)÷T=×ΔA2÷W

ΔA沉淀：沉淀测定值；V反总：反应体系总体积，8.4×10-4L；ε：细胞色素C摩尔消光系数，1.91×L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.04mL；V提取：加入提取液体积，0.4mL；W：样本质量，g；T：反应时间，1min；：单位换算系数，1mol=nmol。

C、样本复合体Ⅳ总活力的计算：

样本复合体Ⅳ总活力即为上清中复合体Ⅳ活力与沉淀中复合体Ⅳ活力之和。

按样本质量计算：复合体Ⅳ（U/g质量）=9×ΔA上清÷W+×ΔA沉淀÷W

转载请注明：http://www.shijichaoguyj.com/wxbzhu/12160.html