软骨下骨破骨细胞诱导感觉神经支配与骨关节
摘要
关节疼痛是骨关节炎(OA)的主要症状，但其起源和机制尚不清楚。在此，我们研究了破骨细胞引发的软骨下骨重塑在OA疼痛感觉神经支配中的前所未有的作用。我们发现破骨细胞分泌神经生长因子1（NETRIN1）来诱导软骨下骨感觉神经轴突生长。通过敲除骨细胞的Rankl减少破骨细胞形成，抑制OA小鼠感觉神经向软骨下骨生长、DRG神经元超兴奋性和疼痛过敏。此外，我们还证明了由破骨细胞分泌的NETRIN1可能通过其受体DCC(大肠癌中缺失的受体)诱导感觉神经支配和OA疼痛，在软骨下异常骨重建过程中发挥作用。重要的是，在抗酒石酸磷酸酶(TRAP)阳性的破骨细胞中敲除Netrin1或敲除Dcc可减少OA疼痛行为。特别是，阿仑膦酸盐抑制破骨细胞活性可改变异常的软骨下骨重建，减少OA早期的神经支配和疼痛行为。这些结果表明，对异常软骨下骨重建的轴突引导分子(如NETRIN1)的干预可能对OA疼痛有治疗潜能。
前言
OA是一种常见的成人肌肉骨骼疾病，预计到年将影响万人，导致残疾和生活质量下降。关节痛是OA的典型症状，但对其病因却知之甚少。目前，OA疼痛通过止痛剂和非甾体类消炎药控制不足，疼痛无法持续缓解，不良反应严重。最近的人源化神经生长因子(NGF)单克隆抗体在缓解严重OA患者的疼痛方面具有巨大的潜力。然而，在临床试验中发现与OA快速进展和骨坏死相关的副作用，以及在临床前试验中检测到的自主神经系统毒性。这一观察提示，更好地理解OA疼痛的病理机制对于开发针对OA疼痛的疾病治疗至关重要。
来自临床和临床前研究的证据表明，来自OA关节的持续痛觉输入驱动中枢和外周神经系统的敏化。脊髓中枢敏化和大脑对脊髓升降通路的失调至少部分解释了OA患者普遍存在的疼痛敏感性。此外，神经胶质细胞、神经元和位于背根神经节(DRG)和中枢神经系统的免疫细胞之间的整合网络的调节已被证明与关节炎疼痛相关。另一方面，局部骨关节炎、细胞因子、趋化因子和炎症因子，包括肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素1(IL)1、IL6、IL17、NGF、前列腺素E2，可因伤害性刺激或轻微刺激引起过度疼痛(痛觉过敏)而引起过敏。在大量的临床前模型中，通过行为测试对外周致敏进行了评估，以表明疼痛。作为外周致敏的基础，关节滑膜、韧带、骨软骨连接、半月板等多个组织由血管周围感觉神经和交感神经支配。无论是动物模型还是人体标本，对神经支配变化的研究都得出了不一致的结论，这可能是因为观察了不同的疾病阶段。在胶原酶诱导模型中的两项研究报告了滑膜神经的短暂性或永久性减少，而另一项在DMM和pkcδ空模型中的研究报告增加滑膜神经支配。氯化金染色显示，神经成分最初在骨关节炎性后交叉韧带(PCL)中减少。而另一项应用CGRP免疫组化的研究显示，在骨关节炎PCL中有持续伤害性感觉神经支配。尤其是血管周围的感觉神经和交感神经纤维被观察到破坏了OA的骨软骨连接。
软骨下骨也可能是软骨下疼痛的一个重要来源，尤其是经磁共振成像显示的软骨下骨髓水肿样病变，与OA疼痛高度相关。唑来膦酸是一种抑制破骨细胞活性的药物，能有效地减轻膝关节疼痛和骨髓水肿样病变的大小。对国家卫生机构骨关节炎倡议的综合数据进行分析，结果表明，双膦酸盐使用者在2和3年时膝关节疼痛明显减轻。在骨关节炎进展中，软骨下骨重塑增加。我们以前报道过异常软骨下骨重塑引发关节软骨退变。具体来说，破骨细胞活性升高会激活过多的TGF-β1，在骨髓中募集间充质干细胞，在骨髓中发生异常的软骨下骨形成。全身或局部注射TGF-β1中和抗体以软骨下骨病理特征为靶点，减轻骨关节炎的进展。OA早期软骨下骨的变化进一步提示了OA疼痛的潜在发病机制。
在哺乳动物神经系统中，神经元轴突在细胞外环境中由特定的线索引导长入组织，这一过程称为轴突引导(也称轴突路径发现)。指导线索有四种类型：NETRINs，SLITs，EPHRINs和SMEAPHORINs。这些信号可以固定或扩散；它们可以吸引或排斥轴突。有趣的是，使用遗传和生化方法结合的研究人员发现，轴突引导分子，例如SEMAPHORINs,NETRINs和EPHRINs，也参与了破骨细胞和成骨细胞之间的分化和交流，这对于骨形成和骨骼内环境稳定是必不可少的。SEMA3A还被证明通过调节感觉神经支配间接地调节骨重塑。在此，我们研究了破骨细胞引发的软骨下骨重塑在OA进展过程中疼痛过敏感觉神经支配过程中的作用。我们发现早期OA中破骨细胞的增加与软骨下骨感觉神经的出现和持续存在密切相关，有证据表明破骨细胞衍生的NETRIN1介导OA疼痛。
本研究从一下5个部分证实破骨细胞产生的NETRIN1介导OA疼痛
1.验证软骨下骨感觉神经支配与OA进展中破骨细胞活动的关系
2.证实Dmp1-Ranklf/f小鼠软骨下骨中感觉神经减少和OA疼痛减轻
3.研究破骨细胞分泌的NETRIN1和轴突生长的关系
4.证实TRAP破骨细胞敲除NETRIN1减少了OA软骨下骨的感觉神经支配和OA疼痛
5.证明NETRIN1通过其DCC受体促进感觉神经支配
6.使用阿仑膦酸盐(ALN)抑制破骨细胞的活动改善OA疼痛和疾病进展
结果
1.软骨下骨感觉神经支配与OA进展中破骨细胞活动有关。
我们首先研究了破骨细胞在软骨下骨感觉神经支配中的潜在作用，因为我们已经证实OA早期破骨细胞的增加，以及破骨前体细胞诱导血管生成。将小鼠前交叉韧带横断，建立ACLTOA模型。在不同时间点取ACLT骨关节，进行软骨下骨的免疫组织学分析。
术后2周，关节软骨蛋白多糖染色(红色)减少和关节软骨表面变得粗糙，提示软骨基质退变。术后4周，胫骨关节软骨内出现小病灶，8周时病变深至钙化软骨（图1A）。抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)阳性破骨细胞早在ACLT术后1周就在软骨下骨中增加，并在2周时维持在较高水平（图1A，图1B）。破骨细胞骨吸收在8周时产生大的骨髓空洞(图1A，第二行)。对胫骨软骨下骨后部和前部进行了成像，并进行了分析（补图2，全关节降钙素基因相关肽(CGRP)免疫染色）。CGRP是一种能引起疼痛致敏的强效血管扩张剂，免疫组化染色显示肽能伤害性神经纤维在术后1周开始异常分布于骨小梁表面附近。ACLT手术后8周，神经末梢数目和密度仍在增加（图1A，第三排；图1C）。
在相应的时间点，假手术组在软骨下骨中很少观察到破骨细胞和CGRP感觉神经末梢（补充图1A）。
根据新近提出的感觉神经元的分类，我们还对3种伤害性神经元NF、P2X2和Piezo2进行了染色。有趣的是，在ACLT手术小鼠软骨下骨髓中P2X2和Piezo2的密度也增加，NF保持不变(补充3A及b)。在软骨下骨髓中，其它神经元纤维、PGP9.5和BTUBULIN的染色显示ACLT手术后仅有微小改变(补充3A及b)。
这些结果表明，OA软骨下骨中不同亚群伤害性神经元的整体神经支配增加。由于软骨退变和软骨下骨破坏似乎优先发生在膝关节后部，我们进一步分析了CGRP神经在软骨下骨2种不同部位的分布情况。有趣的是，前后室之间无显着性差异(补充图3C)。
为了评估软骨下骨的感觉神经支配是否与OA疼痛有关，我们分析了Pirt-GCaMP3小鼠的DRG神经元活性。在Pirt-GCaMP3小鼠中，Trp(Pirt)基因磷酸肌醇相互作用调节剂（主要在伤害性神经元中表达）的整个编码区被Pirt启动子框架中的Ca2+指示物(GCaMP3)所取代，从而使DRG神经元表达基因编码的Ca2+敏感指标。该小鼠模型允许检测DRG中初级感觉神经元的外周神经元活动增加。我们观察到膝关节在ACLT术后1周时，老鼠针刺镇痛仪产生的机械力作用下，活化的DRG神经元数量显著增加，4周时增加到70±5个神经元，8周时神经元保持稳定（图1A，底部；图1D）。相反，在假手术小鼠中，平均有5-8个神经元在相同的机械力下被激活(补充1B和C)。
Miller和他的同事最近也报道了不稳定的内侧半月板(DMM)模型小鼠中类似的神经元高兴奋性。为了验证软骨下骨CGRP感觉神经支配引起的DRG神经元数量的增加，我们在大鼠软骨下骨中进行了DIL逆行标记实验(由于小鼠软骨下骨内注射染料的技术难度，用大鼠代替小鼠)。事实上，ACLT组L4-5DRG中DIL标记的CGRP神经元数量明显多于假手术组(图1E和F)。
DIL标记的IB4+神经元数在两组间无显着性差异(P0.05)。（补充图3D和E)。
为了确定特定类型的神经元对膝关节刺激的反应，我们评估了膝刺激在OA进展中激活神经元的大小分布。在ACLT之前，很少有面积大于μm2的神经元被20g膝关节夹所激活，与非伤害性神经元的大小一致。术后膝关节刺激后，小到中型神经元(面积μm2)持续增加，8周时成为主要的激活神经元，与c和Aδ纤维神经元的大小一致，后者主要作为伤害感受器(图2A)。
为了检查膝刺激反应增加的DRG神经元数量是否为引起疼痛的神经元，我们测试了它们是否也是辣椒素敏感的。我们在相同OA小鼠的相同L4DGR上进行了机械力诱发和辣椒素诱发的体内DRG成像实验。在膝关节刺激时，有54个神经元被激活，其中76%的神经元也可被辣椒素(1μm)直接滴入DRG激活(图2B和C)。由于辣椒素能激活一些与疼痛和热感受相关的初级传入神经元，一些亮度较高的大神经元仅被辣椒素激活(图2B，白色箭头)。
这些结果表明，破骨细胞介导的骨吸收的增加导致软骨下骨的感觉神经支配和DRG神经元的高兴奋性。软骨下骨骨重塑与伤害性神经支配高度相关，提示伤害性神经元具有潜在的介导疼痛的作用。
2.Dmp1-Ranklf/f小鼠中软骨下骨中感觉神经的萌发和OA疼痛减轻
接下来我们检验感觉神经支配是否是由破骨细胞引起的，是否与OA疼痛有关。将DMP1-Cre小鼠与RANKL-floxed的小鼠杂交，敲除DMP1+成骨细胞中的RANKL。DMP1成骨细胞是促进破骨细胞分化的RANKL的主要来源。RANKL缺乏导致破骨细胞数量减少和严重的骨骼石化症表型。Dmp1-Rankf/f-ACLT小鼠与Ranklf/f-ACLT小鼠相比，软骨下骨表面的TRAP阳性破骨细胞减少（图3A，第一排；3C）。重要的是，Dmp1-Ranklf/f-ACLT小鼠中CGRP+神经丝密度明显降低(图3A，第二行；图3B)，提示破骨细胞活性与软骨下骨CGRP+感觉神经支配有关。此外，如蛋白多糖染色（3A，第三排）和更低的OARSI评分所示，Dmp1-Ranklf/f-ACLT小鼠与对照Ranklf/f-ACLT小鼠(图3E)相比，关节软骨得到了保护。
CT分析表明,Ranklf/f-ACLT小鼠胫骨软骨下骨量比假手术对照组高20%。Dmp1-Ranklf/f-ACLT小鼠软骨下骨组织体积略有增加(图3A，第四行；图3D)。
与假手术组相比，Ranklf/f-ACLT小鼠的软骨下骨板厚度下降，但Dmp1-Rankf/f-ACLT小鼠却保持一致（补图4A）。Dmp1-Ranklf/f-ACLT小鼠的小梁型因子增加，但低于Ranklf/f-ACLT小鼠(补图4B)。
免疫组化结果显示，Ranklf/f-ACLT组OSTERIX+成骨细胞祖细胞和pSMAD2/3细胞（这些细胞是骨重塑增加的指标）数量明显增加，而Dmp1-Ranklf/f-ACLT小鼠则无明显增加，提示敲除小鼠的软骨下骨重塑极少。（补图4C-E)。
在ACLT后，微填充造影增强血管造影还显示Dmp1-Ranklf/f小鼠软骨下血管的增加较Ranklf/f小鼠减少。（补图4F-H)。这些结果提示Dmp1-Ranklf/f-ACLT小鼠非偶联骨重塑被阻断，并导致感觉神经发芽减少。
为了检查软骨下骨中的感觉神经是否介导疼痛，我们杂交Dmp1-Ranklf/f小鼠和Pirt-GCaMP3小鼠。与Ranklf/f;Pirt-GCaMP3-ACLT小鼠相比，Dmp1-Ranklf/f;Pirt-GCaMP3-ACLT小鼠膝关节刺激所激活的DRG神经元数量明显减少(图3F和G)。
然后分析神经元反应的强度。野生型(WT)和条件性敲除(KO)小鼠的最大反应强度和持续时间在机械力作用下保持一致(图3H)。VonFrey评估的继发性异常性疼痛显示，在RANKLF/F对照小鼠中ACLT诱导的爪撤回阈值（PWTS）显著降低，从1周持续到16周（图3I)。DMP1-RANKLF/F小鼠的PWT在ACLT后第1周显著降低，但PWT很快上调，在2周时与假手术对照组相似（图3I)。
此外，墨迹印迹分析显示，在Ranklf/f对照组的ACLT术后1个月，右后足同侧强度(图2J和K)与接触面积(图2J和L)的百分比与假手术对照组相比有显著差异，Dmp1-Ranklf/f-ACLT小鼠未见此差异。Ranklf/f和Dmp1-Ranklf/f小鼠在同侧步幅长度或后足支撑基(BOS)上无明显变化(P0.05)。（补图4i和j)。这些结果表明，软骨下骨破骨细胞诱导的感觉神经支配可能介导OA疼痛。
3.破骨细胞分泌的NETRIN1和轴突生长
为了研究破骨细胞调节轴索生长的分子机制，我们培养巨噬细胞/单核细胞以分化成破骨细胞，如通过TRAP染色和细胞核数量证实（补图5）。
收集巨噬细胞/单核细胞和破骨细胞的条件培养基，从破骨细胞中筛选促进轴突生长的潜在因子。原代DRG神经元取自成年小鼠，在微流控培养平台的细胞侧进行培养，这是一种广泛应用于轴突损伤和再生研究的体外方法，主要是通过对独立于细胞体的轴突的探测来研究轴突的损伤和再生。
轴突侧的孔内充满不同的条件培养基。破骨细胞条件培养液诱导轴突通过微通道生长进入轴突侧。然而，巨噬细胞/单核细胞条件培养液对轴突生长影响不大(图4A)。这一发现提示破骨细胞条件培养液中分泌了一个或多个扩散因子，促进了轴突的生长。为了鉴定潜在的分泌因子，我们在条件培养基中加入了抗SLIT3、EPHRINB2、SEMA3A和NETRIN1的功能性阻断抗体。抗NETRIN1抗体抑制破骨细胞条件培养液诱导的轴突生长，而其他抗体无效(图4A和B)。
与此相一致的是，小鼠重组NETRIN1肽的加入促进了轴突的生长(图3C和D)。
为了探讨NETRIN1诱导轴突生长的信号机制，我们检测了NETRIN1是否激活焦点粘附激酶(FAK)和PI3K/Akt通路。值得注意的是，NETRIN1诱导FAK和AKT在30min时磷酸化，在90min时达到高峰(图4e)。
有趣的是，如Westernblot分析(图4F)所示，NETRIN1主要在成熟的破骨细胞提取蛋白中表达，并在破骨细胞条件培养液(图4G)中通过酶联免疫吸附试验(ELISA)进一步证实。此外，免疫染色显示NETRIN1与TRAP染色共定位，在ACLT术后2周骨表面表达明显增高，在ACLT术后4周和8周下降至基线水平(图4H和I)。
然后测定Dmp1-Ranklf/f和Ranklf/f小鼠软骨下骨髓中NETRIN1的浓度。ACLTRanklf/f对照小鼠相对于假手术的Ranklf/f小鼠，增加了软骨下骨髓中NETRIN1的浓度(图4J)。Dmp1-Ranklf/f小鼠NETRIN1浓度高于Ranklf/f对照组，但ACLT手术后与假手术对照组比较无显着性增加(图4J)。
此外，我们还检测了NETRIN1在OA患者膝关节软骨下骨中的表达。OA软骨下骨中有更多的TRAP破骨细胞表达NETRIN1(图5A-B，表1)。综上所述，这些发现表明破骨细胞诱导的软骨下骨重塑介导OA疼痛，NETRIN1可能在促进感觉神经支配的进展中起作用。
4.TRAP破骨细胞内NETRIN1的敲除减少了OA软骨下骨的感觉神经支配和OA疼痛
我们随后研究了破骨细胞分泌的NETRIN1在体内软骨下感觉神经支配中的作用。我们将NETRIN1-floxed小鼠(Ntnf/f小鼠)与Trap-Cre小鼠杂交，产生TRAP-Ntnf/f小鼠，在TRAP细胞系中缺失Netrin1。
ACLT后，NETRIN1在Trap-Ntnf/f小鼠软骨下骨中的浓度较WT小鼠明显降低(图6A)。
此外，体外Westernblot和免疫染色结果显示，Trap-Ntnf/f小鼠软骨下骨NETRIN1显著降低(P0.01)。（补图6A和B）。在ACLT后WT和Trap-Ntnf/f小鼠中，番红固绿染色两者表现出类似的软骨退化(图6B)，OARSI评分也反映了这一点(图6C)。
ACLT手术后，胫骨软骨下骨的相关参数在Trap-Ntnf/f和同窝WT两组小鼠中也有类似的变化(图6D和补图6C和D)。
此外，ACLT后，Ntnf/f和Trap-Ntnf/f小鼠软骨下骨重塑率(由OSTERIX成骨祖细胞和pSMAD2/3细胞数指示)增加程度也相同（补图6G-I)，提示Netrin1并不介导OA的进展。
重要的是，虽然ACLT后，TRAP破骨细胞数量增加(图6E，顶部；图6F)，但CGRP感觉神经的密度与假手术对照组相似(图6E，底部；图6G)。这些结果提示破骨细胞分泌的NETRIN1在感觉神经传入软骨下骨中起重要作用。
我们还测量了DRG神经元对机械力的反应。TRAP-Ntnf/f小鼠与Pirt-GCaMP3小鼠杂交，产生的Trap-Ntnf/-;Pirt-GCaMP3小鼠，这种小鼠的DRG神经元具有钙指示剂表达。由于小鼠Pirt(11号染色体，NC_.6，.)和NETRIN1(11号染色体，NC_.6，.)接近，根据连锁和杂交的规律，没有获得纯合子Ntnf/f；Pirt-GCaMP3小鼠。
ELISA分析证实，破骨细胞中NETRIN1等位基因的缺失足以显著降低OA软骨下骨中NETRIN1的含量（补图7C)。
虽然ACLT后杂合子Netrin1敲除小鼠的软骨下骨中可见一些CGRP感觉纤维，但Trap-Ntnf/-;Pirt-GCaMP3小鼠的CGRP神经末梢的密度(补编7A和B)和DRG激活神经元数(图6H和I)明显少于Ntnf/f;Pirt-GCaMP3小鼠。然后分析神经元反应的强度。在机械力作用下，Ntnf/f;Pirt-GCaMP3和Trap-Ntnf/-;Pirt-GCaMP3两组之间的神经反应最大震幅和持续时间一致(图6J)。
为了检测软骨下骨感觉神经支配是否介导OA疼痛，我们测定了Trap-Ntnf/f小鼠的PWT。ACLT手术后1~16周，Ntnf/f小鼠PWT显著降低(图6k)。然而，在Trap-Ntnf/f小鼠中，PWT的下降并不持续，在1周的急性期后升高(图6k)。
在Netrin1杂合子Trao-Ntnf/-小鼠中也发现了类似的但效果不太明显的PWT上调(补编7D)。
墨迹印迹分析显示，ACLT术前术后相比WT小鼠右后足同侧强度(图6L和M)和接触面积(图6L和N)的百分比有了显著性变化(P0.05)。但在Trap-Ntnf/fACTL组与假手术组相比无明显差异(P0.05)。
Ntnf/f组、TRAP-ntnf/fACTL组、sham组之间比较，右后足同侧步幅长度和后足支撑基百分比无明显差异(P0.05)。（补图6e和f)。
因此，破骨细胞分泌的NETRIN1刺激感觉神经支配进入OA软骨下骨，介导慢性OA疼痛，但对OA进展无影响。
5.NETRIN1通过其DCC受体促进感觉神经支配
为了鉴定NETRIN1的促进神经元生长的受体，我们首先在体外微流体试验中使用scramble、抗DCC或抗Unc5等小干扰RNA(siRNA)处理DRG神经元。敲除DCC的表达，但不敲除Unc5，阻断了破骨细胞条件培养基诱导的轴突生长(图7A)，提示NETRIN1通过DCC发挥其具有吸引力的功能。
我们通过体内实验测试了DCC对感觉神经纤维神经支配的必要性。通过将siRNA注射入WT小鼠尾静脉中引起DCC敲除并不能阻止OA的发展，膝关节软骨退变和OARSI评分等指标可证明这些结论(图7B，顶部；图7C)。然而，在ACLT后，SiDcc处理组与用scramblesiRNA处理的小鼠相比，其DCC(图7B,中间；图7C)和CGRP阳性(图7B,底部；图7C)的感觉纤维的数量明显下降。
我们进一步测试了Ambion在体内抑制感觉神经支配是否能改善OA疼痛。ACLT处理4周后，siDcc处理的ACLT小鼠的PWT明显高于scramblesiRNA处理的小鼠，并持续到8周(图7D)。
步态参数采用猫步态分析系统进行测量。在注射scramblesiRNA的ACLT小鼠中，左足/右足(LH/RH)爪压、LH/RH打印面积比、摆动速度均明显降低(图7E)，而这些在siDcc注射小鼠组中均有所减轻。这些结果表明，抑制软骨下骨中DCC的表达可以减轻ACLT术后的OA疼痛。
6.阿仑膦酸盐(ALN)对破骨细胞的抑制用改善疼痛和疾病进展
双膦酸盐是一类抑制破骨细胞吸收活性和诱导破骨细胞凋亡的抗吸收物。在各种手术动物模型中，双膦酸盐ALN通过软骨保护作用和抑制软骨下骨重塑，被证明是一种潜在的延缓OA发展的治疗药物。
与ACLT诱导的OA相比，DMM诱导的OA关节生物力学不平衡，导致相对缓慢的疾病进展，通常被认为与临床过程更为贴近。此外，标准止痛药能治疗DMM小鼠的疼痛，使该模型更理想地检验了镇痛药对OA疼痛发展的影响。因此，在我们的干预研究中，我们使用DMM模型来检验阿仑膦酸酯对OA疼痛缓解的影响。
软骨下骨NETRIN1表达的时程分析显示，DMM处理后2周时NETRIN1染色密度明显高于假手术组，4周达高峰(补图8A和B)。与ACLT小鼠软骨下骨相比，这似乎是一种延迟反应，与DMM模型中疾病进展较慢相一致。
与ACLT小鼠的结果相似，DMM小鼠中的CGRP免疫染色显示，术后1周开始，邻近骨小梁表面的肽能伤害性神经纤维的分布增加(补图8A和C)。DMM手术后8周，神经末梢数目和密度仍在增加。
在DMM手术后8周，对照处理的小鼠番红O染色变差，软骨表面缺损或纤维形成，OARSI评分显著提高(图8A，顶部；图8B，顶部)。与ACLTOA模型类似，DMM小鼠软骨下骨中的破骨细胞(图8A，中部；图8B，中部)和CGRP感觉神经(图8A，底部；图8B，底部)也增加。ALN治疗可减轻OA的进展、减少破骨细胞的数量和CGRP感觉神经的数目(图8A和B，中下部)。
ALN处理也减少了NETRIN1在软骨下骨的染色(图8C)。此外，相对于对照处理的小鼠，ALN处理DMM小鼠在4周后减少了PWT的下降，并持续至8周时保持不变(图8D)。通过步态分析，我们发现DMM手术导致LH/RH打印面积、工作循环、摆动速度和增肌了摆动时相。ALN治疗(图8E)阻止了这些改变，提示ALN抑制破骨细胞活性可以减轻OA疼痛。
参考文献：
ZhuS,ZhuJ,ZhenG,etal.Subchondralboneosteoclastsinducesensoryinnervationandosteoarthritispain[J].TheJournalofclinicalinvestigation,,(3).
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